Компании двух центров биотехнологий - США и Европы - в 2015 году заработали более $133 млрд, а к 2017 году эта число превысит уже $220 млрд. Инвесторы называют биотехнологии самой интересной индустрией для вложений. Обозреватель сайт рассказал об известных биотехнологических компаниях, которые находятся в России, и об инвесторах и фондах, которые вкладывают средства в направление.
Современные биотехнологические проекты выглядят так, словно только что вышли из научно-фантастической книги. Например, американская компания Bioquark планирует оживить 20 клинически мертвых людей (результаты эксперимента будут доступны в апреле 2017 года), южнокорейский стартап Sooam Biotech готов клонировать домашнего питомца за $100 тысяч, а ученый Массачусетского технологического института создал компанию Elysium, которая разрабатывает таблетку, возвращающую молодость.
Цели и достижения этих компаний растиражированы СМИ, и на самом деле их успехи вполне могут оказаться более скромными. Однако инвесторы с особым интересом наблюдают за сферой биотехнологий. «Если бы в мире осталась одна ценная индустрия, я бы хотел, чтобы это были биотехнологии», - партнёр инвестиционного банка Stifel Nicolaus Чад Морганлэндер.
Центрами развития биотехнологий считаются США и Европа. К концу 2015 года в этих регионах было зарегистрировано пять тысяч публичных компаний, в которых работают более 200 тысяч человек, а объём индустрии составляет $350 млрд.
Биотехнологии повсюду - в США, например, более 90% кукурузы и сои являются генномодифицированной. В Европе ГМО запрещены в большинстве стран, но пища для скота также генетически модифицирована. Один из самых известных препаратов инсулина «Актрапид» также делается с помощью генной инженерии. Самым продаваемым биотехнологическим препаратом является «Хумира» (продано на $12 млн в 2014 году), которую используют при артрите.
Обозреватель сайт узнал, какие биотехнологические стартапы существуют в России и чем они занимаются.
Ohmygut
В феврале 2015 года в компанию инвестировал фонд Maxfield Capital. Инвестиции будут использованы для развития продукта, создания сети продаж и защиты интеллектуальной собственности.
Diagnostic Reagents & Devices, DRD
Компания DRD занимается разработкой диагностических устройств гемотестов, которые позволяют определить различные повреждения мозга: ишемический инсульт и черепно-мозговые травмы. Такие тесты можно применять в критических ситуациях, чтобы выяснить степень травмы больного.
В июне компания заняла второе место на международном конкурсе Asian Entrepreneurship Award в Токио и получила 500 тысяч йен ($5 тысяч) и три года бесплатной работы в токийском коворкинге. DRD является резидентом фонда «Сколково».
Экспресс-тесты работают на основе биомаркеров повреждения мозга - это пептиды и антитела к NMDA и AMPA рецепторам. Согласно многочисленным клиническим исследованиям, биомаркеры высоко специфичны и чувствительны к повреждениям мозга ишемического и травматического характера
- основатель DRD Анжей Жимбиев
«Моторика »
У компании по разработке протезов «Моторика» два продукта: тяговый активный протез кисти и миоэлектрический модуль искусственной кисти Stradivary. Первый протез подходит людям с частичными травмами кисти, при которых сохраняется подвижность лучезапястного сустава. Протез одевается сверху на поврежденную кисть.
Модуль Stradivary полностью заменяет поврежденную кисть и выполняет движения, считывая электрический ток, вырабатываемый мышцами культи в момент их сокращения. Stradivary даёт возможность пользоваться ложкой, вилкой шариковой ручкой и прочими предметами мелкой моторики. Модуль находится на стадии прототипа и будет готов к испытаниям к ноябрю 2016 года.
Как и в случае с компанией MaxBionic, протез «Моторики» можно получить бесплатно, обратившись к производителю.
Какие фонды поддерживают биотехнологические стартапы
В России немало конференций и инвестиционных фондов, поддерживающих молодые компании и стартапы в сфере биотехнологий. В инновационном центре «Сколково» есть кластер « Биомед », который помогает «проектам инициированные врачами, химиками, биологами, генетиками конвертироваться в успешные бизнесы».
Исполнительным директором кластера биотехнологий «Сколково» является Кирилл Каем. До этого Каем был владельцем собственного бизнеса по дистрибуции медицинского оборудования и фармацевтики. Он также возглавлял холдинг Hygiene Kinetics, который производит целлюлозно-бумажные товары и федеральную сеть клиник «Альфа Групп».
Консалтинговая компания Frost & Sullivan отмечает
В связи с последними событиями у всех на слуху слово «импортозамещение». Его применяют к месту и не к месту, под него выделяют огромное финансирование. Но мало кто помнит тех, кто ещё 10 лет назад были первопроходцами в деле реального создания конкурентоспособных технологий. Одним из таких центров является Опытное биотехнологическое производство ИБХ РАН, где в 2003 году начали выпуск генно-инженерного инсулина человека по первой в России технологии полного цикла, за что работавшие над этим сотрудники в 2006 году были удостоены премии Правительства РФ в области науки и техники. И с тех пор в ОБП был разработан целый ряд технологий производства биологических препаратов. Каких и в чём вообще заключается разработка - читайте в этой статье.
Обычно выделяют четыре «цветных» направления биотехнологии: «красная», «синяя», «белая» и «зелёная». «Белая» - промышленная - является одной из самых старых отраслей. Она занимается крупнотоннажным производством различных химических соединений, применяемых в быту: витаминов, спирта и т.д. «Синяя» - морская - занимается приложением биотехнологии к проблемам рационального использования ресурсов океанов. К весьма перспективным направлениям относят «зелёную» отрасль - растительную, в которой генетически модифицируют деревья и сельхозкультуры, а также разрабатывают методы переработки растительного сырья и отходов в полезную для промышленности продукцию. В этом она близка «белой» и по сути является её развитием на более высоком уровне. Но больше всего развито «красное» направление, в котором создаётся продукция для медицинского применения, в основном - биофармацевтические препараты.
Страницы истории
Начало становлению медицинской биотехнологии было положено давно, ещё в начале 70-х годов прошлого века с изобретения технологии рекомбинантной ДНК . А уже в 1982 году был зарегистрирован первый препарат, полученный таким способом - инсулин. В Советском Союзе понимали перспективы этого нового направления, и по настоянию академика Ю.А. Овчинникова, директора , в открытом в 1984 году новом здании института целых два корпуса было выделено под комплексную опытную установку. Основной её задачей являлась разработка технологий получения фармпрепаратов, в особенности биотехнологической природы. Оснащение для тех лет было вполне на мировом уровне, однако перестройка и развал Советского Союза наложили негативный отпечаток - в 90-е годы опытная установка стала не нужна, и большинство специалистов ушло.
Технология рекомбинантной ДНК
Осенью на «биомолекуле» мы опубликовали статью студентки Пермского государственного национального исследовательского университета « » . И хотя речь в ней не о разработке препарата для крупной промышленности, статья даёт представление обо всех этапах получения патента на определённый штамм микроорганизма, созданный биотехнологическим путём. - Ред.
Для задач непосредственно производства создаётся специальный рабочий банк из сотен ампул, каждая из которых предназначена для получения отдельной партии препарата. Этот банк также закладывается на хранение в музей культур (рис. 2).
Далее проводится разработка основной биотехнологической стадии - культивирования клеток. В её ходе выбирают оптимальный состав среды, на которой выращивают клетки, режим культивирования (непрерывный или периодический), его аппаратурное оформление и параметры (pH, температура, скорость подачи и состав подпитки). Основная цель, преследуемая на этом этапе, - повышение объёмной продуктивности, что позволяет получать на оборудовании небольшого масштаба большое количество продукта, достаточное для решения испытательной задачи. Кроме того, за счёт этого снижается и себестоимость получения продукта - в десятки, а то и сотни раз от первоначального лабораторного способа. Решением всех этих задач занимается цех экспериментальной ферментации опытного производства (рис. 3).
Рисунок 3. Контроль за ходом процесса в пилотном ферментёре рабочим объёмом 20 л в цехе экспериментальной ферментации.
В конце культивирования получается культуральная жидкость, содержащая помимо отработанной среды и биомассы клеток ещё и продукт, который необходимо выделить. В зависимости от выбранного вида клеток, продукт может либо выделяться в среду, либо синтезироваться внутри клеток, иногда в виде телец включения (агрегатов из белков). А если смотреть шире, то в случае клеточной или тканевой терапии продуктом будут сами клетки. При выделении сначала отделяют клетки (биомассу) от отработанной среды. Если продукт содержится в среде, то в работу идёт она, а клетки направляют на дезактивацию (в отходы).
Если же продукт получается в тельцах включения, то дезактивируют среду, а клетки разрушают, выделяют тельца и растворяют (солюбилизируют) их. Полученный раствор помимо продукта содержит ещё и белки, выделяемые клетками в среду или синтезирующиеся в виде телец включения, так что для достижения «фармацевтической» степени чистоты требуется несколько ступеней очистки. Чаще всего это несколько (от двух) различных типов хроматографических процессов: ионообменного, гидрофобного, обращённо-фазового, гель-фильтрационного (рис. 4). Для каждого продукта их последовательность и количество будут разные и требуют подбора на основе литературных данных, опыта и экспериментов. Кроме того, для каждого процесса нужно выбирать буферные растворы и стратегию их подачи на хроматографическую колонну. Конечная цель - это продукт высочайшей степени чистоты: иногда более 99,9%, а это означает, что все возможные примеси могут составлять не более 0,1% от массы активной фармацевтической субстанции - результата этой стадии. Очисткой и разработкой её стратегии в рамках опытного биотехнологического производства занимается цех выделения и очистки .
Рисунок 4. Производственное оборудование. Слева: Препаративный хроматограф и буферные растворы, применяемые для крупномасштабной очистки биопрепаратов. Справа: Кристаллизация инсулина в цехе выделения и очистки.
Однако для проведения доклинических и клинических исследований субстанции недостаточно, необходимо ещё изготовить готовую лекарственную форму (ГЛФ) - добавить вспомогательные вещества и упаковать во флаконы или картриджи для шприц-ручек. И если способ упаковки в основном зависит от аппаратного оформления конкретного производства, то вспомогательные вещества в большей степени зависят от препарата и для каждого подбираются отдельно. Хотя здесь не требуется сложных статистических методов и большого количества экспериментов, процесс получения ГЛФ довольно трудоёмкий, и им также занимается отдельное подразделение - цех готовых лекарственных форм (рис. 5).
Немного о терминах
Когда говорят о фармпрепаратах, часто произносят два термина: активная фармацевтическая субстанция (АФС) и готовая лекарственная форма (ГЛФ). АФС или просто субстанция - по сути, главное действующее вещество, которое и отвечает за основной эффект препарата. ГЛФ или готовая форма - это АФС вместе со вспомогательными веществами и в определённом виде: таблетки, капсулы, раствора во флаконе или картридже.
Рисунок 5. Работа в «чистой» зоне. Слева: Разлив готовой формы биопрепарата в цехе готовых лекарственных форм. Справа: Контроль процесса разлива в цехе готовых лекарственных форм. Эффектный комбинезон совсем не для того, чтобы смотреться круто. Конечную форму производят в стерильных условиях в крайне чистой среде. Чтобы в окружающую среду не попадало лишних частиц, все части тела изолируются, а вся косметика перед входом в чистую зону смывается. Работать в таких условиях весьма непросто - несколько часов, и ты уже готов одним махом опустошить полуторалитровую бутылку воды. Не говоря уже о том, что всё это время ты будешь мечтать о дýше.
Казалось бы, дойдя уже до готовой формы, можно переходить непосредственно к доклиническим исследованиям, ведь именно это чаще всего является целью производства лекарственных веществ на мощностях ОБП. Однако прежде необходимо проанализировать полученный продукт, чтобы убедиться в соответствии его характеристик ожидаемым и заложить конкретные параметры в регистрационное досье, которое необходимо для регистрации препарата в регуляторных органах. На данном этапе важно показать, что количество примесей не превышает разрешённого, а полученное основное действующее вещество имеет структуру и активность, соответствующие ожидаемым. Спектр применяемых здесь методов довольно широк: вестерн-блот , изоэлектрофокусировка , хроматография, ЛАЛ-тест , масс-спектрометрия, имунноферментный анализ , ИК-спектроскопия и многие другие. Выбор конкретных методов зависит в первую очередь от природы биопрепарата и для каждого из них во многом индивидуален. Хотя есть и стандартные общие методы вроде электрофореза в полиакриламидном геле или изоэлектрофокусировки. В большинстве же методов, пусть они и являются стандартными в части общей последовательности действий, параметры проведения нуждаются в отдельной проработке для каждой готовой формы, так как вспомогательные вещества иногда влияют на аналитические характеристики основного.
Описанный этап является крайне важным, так как даёт оценку качественным характеристикам препарата и их постоянству от партии к партии. Технология - это не только получение какого-то конкретного продукта и достижение высокой эффективности процесса. Это ещё и умение стабильно обеспечивать высокое качество продукта. Помимо контроля конечного продукта осуществляют промежуточный контроль критических точек производственного процесса, чтобы как можно раньше выявить отклонения, способные повлиять на качество конечного препарата, и минимизировать время и затраты на их устранение. На опытном биотехнологическом производстве за этот этап отвечает отдел контроля качества при участии контрольно-аналитической лаборатории (рис. 6).
Рисунок 6. Важен контроль! Слева: Контрольно-аналитическая лаборатория - все в сборе. Справа: Микробиологический контроль образцов с производства в отделе контроля качества.
Разведка боем
Занимаясь биотехнологией, ты вынужден постоянно знакомиться с новыми передовыми научными достижениями в разных областях: молекулярной биологии, синтетической биологии, химическом приборостроении, IT и многих других. При правильном сочетании полученных знаний и рождается эффективная технология. Это трудный, кропотливый, но очень увлекательный процесс.
Но самые сильные, ни с чем, пожалуй, несравнимые чувства испытываешь, когда, используя инструментарий, созданный природой в ходе эволюции и модифицированный с помощью технологии рекомбинантной ДНК, удается получить конкретный лекарственный препарат, который, возможно, кому-то облегчит состояние, а кого-то и спасет. Это просто круто!
Сотрудник группы эукариотических продуцентов Даниил Павленко раскрывает этот вопрос несколько иначе:
Меня всегда привлекало ориентированное на практику творчество. Создание чего-то, что не просто работает, но ещё и делает это эффективно, т.е. с затратой минимума ресурсов, дарит массу положительных эмоций. Биотех хорош тем, что здесь простор для творчества просто огромен: можно заниматься разработкой сред для выращивания культур, можно основательно вложиться в разработку классного вектора, можно подбирать оптимальные настройки аппаратного обеспечения, можно менять метаболизм клеток-продуцентов, а уж какой простор открывается, если заняться созданием уникальных аппаратов и технологических линий!.. Впечатляют и возможные результаты: комбинация всех подходов может привести к понижению себестоимости производства на порядок, а то и два. Так, мы в своей технологии получения фолликул-стимулирующего гормона определенным изменением достигли увеличения продуктивности, а, следовательно, и уменьшения себестоимости, в 3,5 раза. И понимаем, куда надо двигаться, чтобы повысить продуктивность ещё раз в 5–10. Не удивительно, что от этого всего захватывает дух.
За науку
В прикладных исследованиях научные публикации - дело пусть и не десятое, но явно отходящее на второй план. Основными результатами деятельности являются патенты, ноу-хау, регламенты на конкретные препараты. Статьи же по прикладным исследованиям обычно публикуются в специализированных журналах с соответствующей тематикой, импакт-фактор у которых обычно не переваливает за 3. С фундаментальными исследованиями здесь конкурировать не выйдет, но это не значит, что на опытном производстве науки нет совсем. Например, коллективом ОБП были обнаружены такие явления как антимикробное действие шиконина или эффект вытеснения при очистке генно-инженерного инсулина человека. Хотя большинство статей посвящено разработке отдельных производственных стадий, методов анализа или целых технологий .
Не только работа
Несмотря на серьёзность задач и практическую ориентированность, сотрудники ОБП - живые люди и не прочь поболтать «за жизнь». Собираются обычно пятничными вечерами в кабинете начальника производства Василия Степаненко, который, понимая, что задуманное на остаток дня ему завершить уже не дадут, также включается в беседу. Хотя и тут всё начинается с обсуждения текущих дел и задач и, перетекая в обсуждение стратегии и состояния дел в России и мире, в итоге выходит на разговор о философских и мировоззренческих вопросах.
Обучение без отрыва от производства
Несмотря на высокий уровень ответственности, на ОБП есть успешный опыт выполнения работ студентами и аспирантами с защитой ими магистерских и кандидатских диссертаций. В основном на базе ОБП выполнялись работы вроде создания схем отдельных этапов в производстве какого-либо препарата, подбора условий проведения процессов с целью увеличения выхода, разработки и валидации аналитических методик. Но помимо задач, связанных непосредственно с разработкой технологий создания биологических препаратов, позиционирование производства как опытного подразумевает и возможность отработки различных технических решений. Так, сейчас начато сотрудничество с Университетом машиностроения по направлению разработки различных приборов и аппаратов, применяемых в биотехнологическом производстве.
При этом идей, куда можно двигаться, и каким будет будущее «красной» биотехнологии, предостаточно. Если смотреть глобально, то есть несколько возможных направлений:
В каком направлении всё двинется? Пока сказать сложно, но во многом это будет зависеть от молодёжи, полной прорывных идей и мотивации к созиданию нового.
Литература
- Полякова М. (2010). Несахарное производство . Сайт ИБХ ;
- Молекулярное клонирование, или как засунуть в клетку чужеродный генетический материал ;
- Прикладная биотехнология и молекулярная микробиология. Практическое руководство для студентов, или как запатентовать биопрепарат ;
- Karyagina T.B., Arzumanyan V.G., Timchenko T.V., Bairamashvili D.I. (2001). Antimicrobial activity of shikonin preparations . Pharm. Chem. J. 35 , 435–436;
- Gusarov D., Nekipelova V., Gusarova V., Lasman V., Bairamashvili D. (2009). Displacement effect during HPLC preparative purification of human insulin . J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 877 , 1216–1220;
- Gusarov D.A., Sokolova I.V., Gusarova V.D., Evteeva E.A., Vorob’eva T.V., Kosarev S.A. (2012). Development of effective pilot-scale technology for producing N,N-bis-met-histone H1.3 used for lymphoma treatment . Pharm. Chem. J. 46 , 234–240;
- Urmantseva V.V., Gaevskaya O.A., Karyagina T.B., Bairamashvili D.I. (2005). The effect of amino acids as components of nutrient medium on the accumulation of protoberberine alkaloids in the cell culture of Thalictrum minus . Russ. J. Plant Physiol. 52 , 388–391;
- Gusarova V., Vorobjeva T., Gusarov D., Lasman V., Bayramashvili D. (2007). Size-exclusion chromatography based on silica-diol for the analysis of the proinsulin fusion protein . J. Chromatogr. A. 1176 , 157–162;
- Zhang Y.H. (2010). Production of biocommodities and bioelectricity by cell-free synthetic enzymatic pathway biotransformations: challenges and opportunities . Biotechnol. Bioeng. 105 , 663–677;
Многообразие форм живой материи и новые знания в области физики и химии живых систем позволяют конструировать биологические системы различной степени сложности и организации, продуцирующие широчайший спектр макромолекул. Фундаментальные знания о молекулярной организации и закономерностях функционирования биосинтетических путей являются основой для метаболической инженерии биосистем суперпродукции макромолекул с заданными свойствами.
На смену ставших рутинными биотехнологическим продуктам (белку одноклеточных, биоудобрениям и биогазу, органическим кислотам, аминокислотам) приходят новые продукты и препараты, среди которых - средства диагностики и лечения на основе технологий генетической инженерии и клонирования, вакцины, сыворотки, моноклональные антитела, экологически чистые материалы, а также биоинженерная аппаратура нового поколения для реализации биотехнологических процессов.
Ведущие фирмы (табл. 1.3) в области биотехнологии в течение небольшого периода (с 1978 до 1982 гг. - период взрыва мирового рынка генно-инженерных продуктов) увеличили свои активы более чем в 30 раз; при этом их годовой доход возрос при этом с 5 до 67 млн дол.
Таблица 1.3. Динамика мирового рынка продукции биотехнологии, млрд дол.
Десятки новых препаратов ежегодно проходят различные стадии законодательного утверждения. Среди них - диагностикумы вируса В, СПИДа и др., моноклональные антитела, конъюгированные с растительными токсинами, эффективные противоопухолевые препараты, генные диагностикумы и пр.
К 2000 г. на мировом рынке биотехнологических продуктов доля медицинских препаратов, полученных только в США методами клеточной и генетической инженерии, достигла свыше 30 млрд дол., что составило около 60 % всех затрат.
Перечень медицинских препаратов, прошедших все стадии исследований и допущенных на рынок за период с конца 80-х гг. до 2004 г., существенно расширился. Ежегодно в США FDA (Администрация по продуктам питания и препаратам) выдает порядка 30-40 разрешений на серийное производство и применение биотехнологических препаратов и вакцин.
Помимо полученных и выпущенных на рынок в 1981 г. рекомбинантных инсулина, гормона роста, иммунно-глобулинов и эритропоэтина, появились следующие препараты: липосомальная форма противогрибкового препарата, активатор тканевого плазминогена; рекомбинантные факторы свертывания крови; человеческий альбумин; заменитель человеческой кожи, состоящий из коллагена, фибробластов и кератиноцитов; культивированные аутологичные хондроциты; липосомальная форма химиотерапевтического агента даунорубицина; вакцины против гепатита В и для лечения хронического гепатита С; рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон для лечения бесплодия; биоинженерный коллагеновый матрикс для реконструкции мышечной ткани; препараты для диагностики и лечения ВИЧ-инфекции; костный трансплантат, содержащий рекомбинантный костный морфогенетический протеин (rhBMP-2); гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор при проведении аутологичных трансплантаций костного мозга; ботулинический токсин типа В и др.
Японский рынок биотехнологических диагностикумов и препаратов в 2000 г. составил свыше 30 млрд дол.; среди них - препараты для лечения первичных и приобретенных иммунодефицитов, аутоиммунных состояний, вирусных и микробных инфекций, злокачественных новообразований, иммуноспецифических синдромов при шоке, лучевой и ожоговых болезнях.
Серьезный прорыв был достигнут в области получения трансгенных сортов культурных растений, это генно-инженерный сорт сладкой («золотой») кукурузы; гибридные сорта кукурузы, рапса, пшеницы и сои с генами устойчивости к насекомым и гербицидам; трансгенные сорта хлопка, устойчивые к вилту, вредителям и гербицидам; трансгенные сорта папайи с красной и желтой мякотью, устойчивые к вирусу кольцевой пятнистости; а также генетически модифицированные фрукты и овощи с удлиненным сроком хранения (сорта томатов и клубники, не портящиеся при длительном хранении за счет снижения синтеза этилена, ускоряющего процесс физиологического дозревания плодов).
В области рыбоводства были получены модифицированные быстрорастущие морепродукты (лосось, камбала), достигающие товарной массы в течение одного-полутора лет, по сравнению с двумя-тремя годами, требующимися для лососей традиционных пород и др.
Объем рынка биотехнологий в мире к 2005 г. оценивался примерно в 200 млрд дол. США. Ежегодный рост в настоящее время составляет около 7-9 %. Для рынка биотехнологий в мире 2005 г. можно охарактеризовать как один из самых успешных за всю историю развития этой отрасли. В этот период правительства стран Европы и Азии продолжали демонстрировать энтузиазм по отношению к индустрии биотехнологий и инвестировать миллиарды долларов в эту отрасль, считая ее одним из приоритетов экономического развития своих государств.
В настоящее время компании, связанные с биотехнологией и медициной, начинают выдвигаться на ведущие позиции в рейтингах по различным приоритетам. Так, журнал Fortune опубликовал ежегодный рейтинг 100 лучших компаний-работодателей. Лучшим местом работы в США признана компания Google. На втором месте - биотехнологическая компания Genetech. В рейтинге, проводимом компанией «Делойт», по показателям наиболее быстрого роста названы фирмы Anistoma и Biotage, занимающиеся разработкой биотехнологических препаратов для лечения онкологических заболеваний, генетическим анализом и медико-техническими исследованиями, заняли среди стран Европы 3-е и 4-е места, показав рост за 2005 г. на 20 и 13 % соответственно.
Рынок биотехнологий в разных странах имеет свои особенности, обусловленные уровнем развития экономики стран и доходами населения. Наиболее активно в настоящее время ведется разработка лекарственных средств с использованием современной биотехнологии. В США, Японии и отдельных странах Западной Европы на эти цели расходуется в среднем средств, выделяемых на НИОКР в области биотехнологии. Практически во всех этих государствах существуют правительственные программы поддержки биотехнологических компаний.
В США, являющихся лидером в области современной биотехнологии, для проведения фундаментальных и прикладных исследований было образовано много специализированных биотехнологических фирм, которые, привлекая частный и государственный капитал и лучшие научные кадры, в считанные годы разработали и запатентовали способы получения многих белковых продуктов медицинского назначения. К таким фирмам относятся в первую очередь Genentech, Biogen, Amgen, Genetic Institute, Cetus, Immunex и ряд других.
Примерно в это же время к финансированию НИОКР в области современной биотехнологии подключились и крупные транснациональные компании, приобретая акции или лицензии на готовые продукты, а впоследствии создавая собственные исследовательские подразделения. Эти фирмы сыграли решающую роль в промышленном внедрении первых генно-инженерных медицинских препаратов, таких как инсулин, гормон роста человека, интерферон, эритропоэтин, тканевой активатор плазминогена, вакцина против гепатита В и др.
Например, фирма Genentech имеет различные лицензионные соглашения и соглашения о сотрудничестве с Elly Lilly (США), Hoffmann-La Roshe (Швейцария), Takeda, Daiichy Seiyaky, Toray и Fujisawa (Япония), Boeringer Ingelheim, Gruenenthal (Германия), Kabi Vitrum (Швеция).
По данным исследовательской компании Abercade, основными сегментами рынка биотехнологических продуктов в РФ являются фармацевтика (66 %), препараты для сельского хозяйства (18 %), дрожжи (9 %) (рис. 1.1) при весьма низких (порядка 1 %) уровнях остальных продуктов.
Рис. 1.1. Долевой анализ рынка биотехнологии РФ (по данным исследовательской компании Abercade, источник - https://www.abercade.ru/)
Однако нельзя не отметить, что основную долю самого развитого рынка фармацевтических препаратов в РФ (порядка 450 млн дол. США) в настоящее время занимает импортная продукция - это преимущественно инсулины, вакцины, сыворотки. Доля отечественной фармацевтической продукции в совокупном объеме составляет только 60,6 млн дол. США.
Более перспективным выглядит рынок отечественной промышленной биотехнологии, в основном это производство ферментов и средств защиты растений. Объемы продаж ферментных препаратов отечественного производства составляет порядка 12,3 млн дол. США, это 38 % от общего объема этого сегмента рынка.
Преимущественно это ферменты и ферментные препараты для спиртовой промышленности и для животноводства.
Среди биотехнологических препаратов сельскохозяйственного назначения - средства защиты и стимуляторы роста растений, пробиотики, вакцины ветеринарные, кормовые антибиотики, аминокислоты и кормовой белок, витамины, кормовые добавки.
На рынке биотехнологических препаратов для защиты окружающей среды доминирует отечественное производство продукции в размере 8 млн дол. США, а доля импортной продукции (бактериальные препараты для ликвидации нефтяных загрязнений, биосорбенты для очистки воды и донных отложений от нефтепродуктов) составляет только 800 тыс. дол. США. Объемы отечественного производства дрожжей составляют 58 млн дол. США, импорт этого вида биотехнологического продукта - в 3,5 раза меньше.
Направления более наукоемких новейших биотехнологий, базирующихся на достижениях генетической инженерии, в России, к сожалению, только вступают в фазу своего развития. Так, на рынке генетически модифицированных культур, которые занимают в мире площадь 8,1 млн га и их продажи ежегодно растут на 20 %, Россия пока не представлена.
Н.А. Воинов, Т.Г. Волова
Лекция 1
Классификация биотехнологических производств
по технологическим признакам
Биотехнологические методы применяются в химической, пищевой, медицинской и других отраслях промышленности в основе общего технологического признака биотехнологических производств является родственность процессов и оборудования.
Биотехнологические производства делятся на две большие группы.
1. Некоторые пищевые производства по переработке с/х сырья, например, бродильные (пивоварение, виноделие, хлеб и др.). Здесь не культивируются большие массы м.о. Биотехнологическим является какая-либо отдельная стадия процесса. Специфическое оборудование имеет малый удельный вес.
2. Производства, где культивирование м.о. является основной целью. Они делятся на две подгруппы.
2.1. Многотоннажные производства, в которых получают большие количества биомассы м.о. (дрожжи), органических кислот или спиртов. Здесь используется, в основном, глубинный метод культивирования. Высокая степень асептики не требуется, т.к. вероятность проникновения посторонней микрофлоры незначительна. Условия культивирования температура, рН, состав (кислоты и спирты до 5-10%, в производстве дрожжей у.в. нефти) затрудняют рост посторонних м.о. Часто используются анаэробы и анаэробные способы культивирования, которые не способствуют развитию большинства патогенных микробов .
В этих производствах не требуется надежная стерилизация, тонкая очистка воздуха, герметизация и стерилизация оборудования.
Конечные продукты стабильны, и зачастую их выпускают в жидком виде без применения распылительной сушки, иногда применяется тепловая обработка.
2.2. Производства тонкого микробиологического синтеза с получением бактериальных препаратов и веществ со сложной структурой антибиотики, ферменты, а.к., витамины, гормоны, вакцины и т.п.
Здесь основной стадией является выращивание м.о.
Особенностью этих производств является глубинное культивирование и повышенные требования к защите рабочей среды от проникновения посторонней микрофлоры. Это объясняется тем, что условия культивирования являются оптимальными для большинства представителей данной микрофлоры (рН 6,2-7,2, 25-35°, среды содержат у.в., белки и другие питательные вещества).
Продуцентом является не смесь, а индивидуально подобранный штамм.
Здесь высокие требования к герметизации и стерилизации оборудования.
Для выделения и очистки используют ряд сложных методов экстракция, полный обмен и др. Особые требования предъявляются также к расфасовке и хранению продукции, которая выпускается обычно в сухом виде, поскольку продукт нестоек.
В то же время оборудование данной группы производств без существенных переделок легко приспосабливается под выпуск другой продукции.
Требования к асептике постоянно растут.
Особенности основной и звключительных стадий биотехнологического производства
Технологические процессы в биотехнологических производствах такие же, как и в химических массообменные, теплообменные, гидрохимические и механические. Но все они осложнены биологическим фактором.
Важнейшие аспекты биологического фактора заключаются в следующем.
1. Биологическим системам присуще саморегулирование, направленное на ускорение роста.
2. Клеточные м.о. имеют общий химический состав, который включает три класса сложных макромолекул ДНК, РНК и белки.
3. Внутриклеточные процессы протекают с участием специфических белковых катализаторов-ферментов.
4. Вследствие малой концентрации ферментов ограничены возможности стимулировать рост м.о. путем увеличения концентрации субстрата.
5. На всякое внешнее воздействие в клетках возникает реакция, направленная в сторону, благоприятную для жизнедеятельности и на снятие воздействия.
6. Биологическая система развивается, ее состав и потребности меняются, необходимо постоянно регулировать условия ферментации.
7. Клеточная мембрана обладает избирательной проницаемостью, обладает сложными свойствами. Может переносить вещества как по градиенту, так и против градиента концентрации. Это затрудняет регулирование.
Все это объясняет, почему в биотехнологических производствах наряду с разработкой и созданием специального оборудования широко используется типовое химическое.
При проектировании новых биотехнологических производств решаются две задачи:
Масштабирование расчет оборудования на основании данных, полученных в лабораторных условиях и на опытно-промышленных установках;
Оптимизация выбор наиболее выгодного варианта схемы, режима, типа оборудования.
В научных исследованиях, проектировании и на производстве специалист должен знать закономерности и кинетику процессов, методы расчета и главные принципы аппаратурного оформления.
Основные характеристики процесса ферментации при глубинном культивировании
С точки зрения проектирования и методики расчета оборудования наибольшее значение в биотехнологии имеет классификация процессов по способу организации:
1) периодические;
2) непрерывные;
3) многоциклические;
4) объемно-доливные;
5) периодические с подпиткой субстрата;
6) полунепрерывные с подпиткой.
1) Периодический процесс: загрузка сырья и посевного материала производятся единовременно, затем некоторое время идет процесс, после чего ферментационная жидкость выгружается.
2) Непрерывный процесс загрузка и выгрузка среды протекают непрерывно и одновременно с одинаковой скоростью; в итоге объем среды в аппарате не изменяется.
При такой организации не требуется приготовление посевного материала.
4) Объемно-доливные процессы между загрузкой и выгрузкой протекают как периодические, но через некоторое время часть среды выгружают и заменяют свежей.
Интервалы между отборами здесь меньше, а число отборов больше, чем в случае (3), а отбираемая часть жидкости меньше.
Это не строго периодический процесс, экономические характеристики по посевному материалу лучше.
5) Периодический процесс с подпиткой субстрата часть среды загружается в начале ферментации, а другая добавляется непрерывно по мере протекания процесса. Естественным завершением является переполнение аппарата. Поэтому нужно завершать процесс быстро и как периодический с максимальным заполнением.
6) Полунепрерывные с подпиткой субстрата процессы сочетают объемно-доливные и подпиточные.
По достижении определенного состояния биологической системы после подпитки, часть жидкости отбирают, а затем постепенно добавляют субстрат до нового заполнения аппарата.
Фазы и параметры периодической ферментации
Если бы клетки делились синхронно, кинетика описывалась бы экспонентой по аналогии с химической реакцией. Но они делятся асинхронно, и подход иной: т.к. развитие популяции ограничено ресурсами среды.
Показатели роста биомассы:
Общая скорость (1)
Удельная, т.е. по Аррениусу (2)
В экспоненциальной фазе скорость не лимитирована и μ= const .
Если бы процесс с самого начала определялся этой зависимостью, то концентрация биомассы изменялась бы, начиная с X 0 по уравнению:
(3)
Т.к.
Пусть при τ =0, X = X 0 , но если X 0 , то X = X 0 .
После логарифмирования получаем:
Следовательно, в логарифмических координатах график прямолинейный и тангенс угла равен μ.
Другой показатель время генерации время, за которое биомасса удваивается. Можно показать, что:
Размерность μ [ч -1 ] или [мин -1 ]
Для многих бактерий μ=0,5 или даже 1,0 мин -1 .
Для микроводорослей, растительных и животных клеток на уровне 0,01 ч -1 .
Для грибов и актиномицетов значения промежуточные: у психрофилов до 1 час -1 , у мезофилов до 2, у термофилов до 3 ч -1 .
Кинетика потребления субстрата.
S концентрация субстрата
Удельная
Кинетика биосинтеза продукта метаболизма:
Обозначения:
X концентрация биомассы, г/см 3
x координата
P концентрация продукта метаболизма
S концентрация субстрата
Q x скорость прироста биомассы
q удельная скорость прироста биомассы (прирост на единицу биомассы)
τ время
Q p скорость образования продукта метаболизма
q p удельная скорость образования продукта метаболизма
Q s скорость потребления субстрата
q s удельная скорость потребления субстрата
Учебно-методическое пособие для студентов специальности
050701 «Биотехнология»
Шымкент, 2007
УДК 631. 147(075.8)
ББК 30. 16я 73
Составили: Приходько Н. А., Есимова А. М., Надирова Ж.К.
ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПРОИЗВОДСТВА. КОНСПЕКТ ЛЕКЦИЙ. Учебно-методическое пособие для студентов специальности 050701 «Биотехнология» – Шымкент: ЮКГУ им. М. Ауезова,- 2007.- 100с.
Рис. 22, табл. 9, список литературы 15 наим.
Учебно-методическое пособие предназначено для студентов III курса дневной и заочной формы обучения по специальности 050701 «Биотехнология» и включает 8 лекций, содержание которых охватывает программу курса в соответствии с Государственным общеобязательным стандартом образования Республики Казахстан.
Учебно-методическое пособие составлено на основании Государственных общеобязательных стандартов образования РК (Астана, 2001, 2004 (ГОСО РК 3.07.078 – 2001 и ГОСО РК 3.08. – 076 – 2004)
Рецензенты: доцент кафедры биотехнология
к. х. н. Тасыбаева Ш.Б..
© Южно-Казахстанский Государственный университет им. М. Ауезова
Введение
1. Цель, задачи и место дисциплины в учебном процессе
Настоящий курс предназначен для студентов бакалавриата, обучающихся по специальности 050701 – биотехнология. В нем детально рассматриваются основные этапы
В программе освещены вопросы, касающиеся биообъектов, биохимических процессов и сырья биотехнологических производств. Дана характеристика типов культивирования микроорганизмов, способов выделения и очистки конечных продуктов. Особое внимание уделяется значению методов генной инженерии в современной биотехнологии.
Цель курса – ознакомить студентов с основными этапами биотехнологических производств, включая:
Виды сырья;
основой биопроизводств;
Задачи курса
биотехнологических производств.
Минимальная трудоемкость дисциплины по типовому учебному плану составляет 90 часов.
Лекция 1. Введение. Предмет и задачи курса. Биотехнологическое производство как биоиндустрия. Место приложения научных достижений биотехнологии. Перспективы биотехнологических производств
Форма проведения лекции: вводная с проблемными ситуациями
План лекции
1. Введение
2. Предмет и задачи курса
3. Биотехнологическое производство как биоиндустрия
4. Место приложения научных достижений биотехнологии
5. Перспективы биотехнологических производств
1. Биологические технологии (биотехнологии) обеспечивают управляемое получение полезных продуктов для различных сфер человеческой деятельности. Эти технологии базируются на использовании каталитического потенциала различных биологических агентов и систем – микроорганизмов, вирусов, растительных и животных клеток и тканей, а также внеклеточных веществ и компонентов клеток. В настоящее время разработка и освоение биотехнологии занимают важное место в деятельности практически всех стран. Достижение превосходства в биотехнологии является одной их центральных задач в экономической политике развитых стран. Лидерами биотехнологии являются сегодня США и Япония, накопившие многолетний опыт биотехнологий для сельского хозяйства, фармацевтической, пищевой и химической промышленности. Прочное положение в производстве ферментных препаратов, аминокислот, белка, медикаментов занимают страны Западной Европы (ФРГ, Франция, Великобритания), а также Россия. Эти страны характеризуются мощным потенциалом новой техники и технологии, интенсивными фундаментальными и прикладными исследованиями в различных областях биотехнологии. Определить сегодня, что же такое биотехнология, весьма не просто. Вместе с тем, само появление этого термина в нашем словаре глубоко символично. Оно отражает мнение, что применение биотехнологических материалов и принципов в ближайшие годы радикально изменит многие отрасли промышленности и само человеческое общество. Интерес к этой науке и темпы ее развития в последние годы растут очень быстро. Человек использовал биотехнологию многие тысячи лет: люди занимались пивоварением, пекли хлеб, получали кисломолочные продукты, применяли ферментации для получения лекарственных веществ и переработки отходов. Но только новейшие методы биотехнологии, включая методы генетической инженерии, основанные на работе с рекомбинантными ДНК, привели к «биотехнологическому буму», свидетелями которого являемся мы в настоящее время. Новейшие технологии генетической инженерии позволяют существенно усовершенствовать традиционные биотехнологические процессы, а также получать принципиально новыми, ранее недоступными способами разнообразные ценные продукты. Развитие и преобразование биотехнологии обусловлено глубокими переменами, происшедшими в биологии в течение последних 25–30 лет. Основу этих событий составили новые представления в области наследственности и методические усовершенствования, которые приблизили человечество к познанию превращений ее материального субстрата и проложили дорогу новейшим промышленным процессам. Помимо этого, ряд важнейших открытий в других областях также повлиял на развитие биотехнологии
Генетическая инженерия существует немногим более 20 лет. Она блестяще раскрыла свои возможности в области прокариотических организмов. Однако новые технологии, применяемые к высшим растениям и животным, пока не столь значительны. Попытки применения приемов генетической инженерии к высшим растениям и животным сталкиваются с огромными трудностями, обусловленными как несовершенством наших знаний по генетике эукариот, так и сложностью организации высших организмов.
Использование научных достижений и практические успехи биотехнологии тесно связаны с фундаментальными исследованиями и реализуется на самом высоком уровне современной науки. В этом плане нельзя не отметить удивительную научную многоликость биотехнологии: ее развитие и достижения теснейшим образом связаны и зависят от комплекса знаний не только наук биологического профиля, но также и многих других
Сегодня биотехнология стремительно выдвинулась на передние позиции научно-технического прогресса. Фундаментальные исследования жизненных явлений на клеточном и молекулярном уровнях привели к появлению принципиально новых технологий и получению новых продуктов. Традиционные биотехнологические процессы, основанные на брожении, дополняются новыми эффективными процессами получения белков, аминокислот, антибиотиков, ферментов, витаминов, органических кислот и др. Наступила эра новейшей биотехнологии, связанная с получением вакцин, гормонов, интерферонов и др. Важнейшими задачами, стоящими перед биотехнологией сегодня, являются: повышение продуктивности сельскохозяйственных растительных культур и животных, создание новых пород культивируемых в сельском хозяйстве видов, защита окружающей среды и утилизация отходов, создание новых экологически чистых процессов преобразования энергии и получения минеральных ресурсов.
Характеризуя перспективы и роль биотехнологии в человеческом обществе, уместно прибегнуть к высказыванию на одном из Симпозиумов по биотехнологии японского профессора К. Сакагучи, который говорил следующее: «... ищите все, что пожелаете, у микроорганизмов, и они не подведут вас... Изучение и применение в промышленности культур клеток млекопитающих и растений, иммобилизация не только одноклеточных, но и клеток многоклеточных организмов, развитие энзимологии, генетической инженерии, вмешательство в сложный и недостаточно изученный наследственный аппарат растений и животных все больше расширят области применения существующих направлений биотехнологии и создадут принципиально новые направления».
2. Современный этап научно-технического прогресса характеризуется революционными изменениями в биологии, которая становится лидером естествознания. Биология вышла на молекулярный и субклеточный уровень, в ней интенсивно применяются методы смежных наук (физики, химии, математики, кибернетики и др.), системные подходы. Бурное развитие комплекса наук биологического профиля с расширением практической сферы их применения обусловлено также социально-экономическими потребностями общества. Такие актуальные проблемы, стоящие перед человечеством второй половины ХХ века, как дефицит чистой воды и пищевых веществ (в особенности белковых), загрязнение окружающей среды, недостаток сырьевых и энергетических ресурсов, необходимость развития новых средств диагностики и лечения, не могут быть решены традиционными методами. Поэтому возникла острая необходимость в разработке и внедрение принципиально новых методов и технологий. Большая роль в решение комплекса этих проблем отводится биотехнологии, в рамках которой осуществляется целевое применение биологических систем и процессов в различных сферах человеческой деятельности. Цель курса – ознакомить студентов с основными этапами биотехнологических производств, включая:
Виды сырья;
Биообъекты – клетки и ферменты, биохимическая активность которых является
основой биопроизводств;
Процессы, лежащие в основе этих производств;
Выделение, очистка и товарные формы конечных продуктов.
Задачи курса
Показать уникальные возможности микроорганизмов и разнообразие
ферментативных реакций, лежащих в основе биопроизводств;
Дать характеристику сырья, в том числе, недефицитных вторичных
продуктов и отходов ряда производств;
Ознакомить с методами культивирования микроорганизмов;
Дать характеристику этапам получения конечных продуктов
биотехнологических производств.
3. В современной биотехнологии в соответствии со спецификой сфер ее применения целесообразно выделить в качестве самостоятельных ряд разделов следующие:
Промышленная микробиология;
Медицинская биотехнология;
Технологическая биоэнергетика,
Сельскохозяйственная биотехнология;
Биогидрометаллургия;
Инженерная энзимология;
Клеточная и генетическая инженерия;
Экологическая биотехнология.
Перспективность и эффективность применения биотехнологических процессов в различных сферах человеческой деятельности, от получения пищи и напитков до воспроизводства экологически чистых энергоносителей и новых материалов обусловлена их компактностью и одновременно крупномасштабностью, высоким уровнем механизации и производительности труда. Эти процессы поддаются контролю, регулированию и автоматизации. Биотехнологические процессы, в отличие от химических, реализуются в «мягких» условиях, при нормальном давлении, активной реакции и невысоких температурах среды; они в меньшей степени загрязняют окружающую среду отходами и побочными продуктами, мало зависят от климатических и погодных условий, не требуют больших земельных площадей, не нуждаются в применении пестицидов, гербицидов и других, чужеродных для окружающей среды агентов. Поэтому биотехнология в целом и ее отдельные разделы находится в ряду наиболее приоритетных направлений научно-технического прогресса и является ярким примером «высоких технологий», с которыми связывают перспективы развития многих производств. Биологические технологии находятся в настоящее время в фазе бурного развития, но уровень их развития во многом определяется научно-техническим потенциалом страны. Все высокоразвитые страны мира относят биотехнологию к одной из важнейших современных отраслей, считая ее ключевым методом реконструкции промышленности в соответствии с потребностями времени, и принимают меры по стимулированию ее развития.
Биотехнологические процессы многолики по своим историческим корням и по своей структуре, они объединяют элементы фундаментальных наук, а также ряда прикладных отраслей, таких как химическая технология, машиностроение, экономика. Научная многоликость биотехнологии в целом и ее раздела, имеющего целью решение природоохранных задач, удивительна: они использует достижения наук биологического цикла, изучающих надорганизменный уровень (экология), биологические организмы (микробиология, микология), суборганизменные структуры (молекулярная биология, генетика). Через биологию на биотехнологию влияют химия, физика, математика, кибернетика, механика. Современные биотехнологии также остро нуждаются в научно-обоснованной проработке технологии и аппаратурном оформлении. Поэтому необходима органическая связь с техническими науками – машиностроением, электроникой, автоматикой. Общественные и экономические науки также имеют большое значение в развитии экологической биотехнологии, так как решаемые ею практические задачи имеют большое социально-экономическое значение для развития любого общества. К биотехнологии, как ни к одной любой отрасли и области научных знаний, подходят знаменитые слова Луи Пастера: «Нет, и еще тысячу раз нет, я не знаю такой науки, которую можно было бы назвать прикладной. Есть наука и есть области ее применения, и они связаны друг с другом, как плод с взрастившим его деревом».
Современном биологическим технологиям под силу создать отрасли, основанные на функционировании биологических систем, метаболические системы которых обладают уникальными достоинствами и подчинены интересам человечества.
5. Области применения биотехнологии очень разнообразны, она охватывает множество наук и производств, поэтому в настоящее время принято различать следующие виды биотехнологий.
Пищевая биотехнология Это наиболее старое и традиционное использование способностей микроорганизмов в получении пива, вина, кисломолочных продуктов, дрожжей и т.д. С развитием науки будут совершенствоваться два направления:
Производство микроорганизмов, клеток растений и животных в биореакторах, при этом выход будет существенно выше, чем в сельском хозяйстве;
Повышение производительности биотехнологических процессов за счет использования методов генной инженерии.
Таблица 2 - Эффективность биоконверсии сырья
Медицинская биотехнология. Получила развитие благодаря достижениям генной инженерии, например, получение интерферона, инсулина, гормонов роста путем клонирования генов человека в микроорганизмы, широко используются в терапии и диагностике различные ферменты. В будущем будут использованы достижения биоэлектрохимии, например, создаются специальные датчики, определяющие содержание глюкозы, нервных газов, отдельных компонентов крови.
Сельскохозяйственная биотехнология. В данном случае применение очень разнообразно:
Использование продукции и отходов сельского хозяйства в качестве сырья для получения биотехнологических продуктов: спирт, вино, пиво, энергия. Для развития этого направления надо тщательно изучить кинетику разложения различных субстратов и роль микроорганизмов в процессах;
Использование биотехнологии в ветеринарии для получения вакцин и сывороток;
Получение корма для скота: БВК, дрожжевая масса;
Новые способы улучшения сельскохозяйственных культур по урожайности и качеству;
Использование методов биологической фиксации азота вместо традиционных удобрений;
Использование методов биологического контроля вместо пестицидов.
Будущее сельскохозяйственной биотехнологии – это улучшение свойств растений путем использования генной инженерии.
Промышленная биотехнология. Энергетика: солнце → биомасса → энергия. В будущем будут созданы биотопливные элементы, например, водород, образующийся при брожении, используется в кислородно-водородном элементе. Необходимо повысить эффективность конверсии солнечного света в биомассу (обычно это 1 - 2%). Решаются также вопросы получения Н 2 путем расщепления Н 2 О фотосинтезирующими микроорганизмами (сине-зеленые водоросли). Перспективно использование микроорганизмов в нефтедобывающей промышленности как ПАВ или полимеры.
Химические соединения. Биохимический способ их получения имеет преимущества: специфичность, легкость контроля, низкие температуры, экологичность, простота. Можно получать спирт, метан, кислоты, ацетон, аминокислоты, ферменты, антибиотики и др. Но пока традиционные способы синтеза преобладают. В будущем планируется производство пластмасс, эмульгаторов и загустителей. Материалы.
Биотехнология способствует развитию добычи промышленного сырья, например нефти;
Микроорганизмы используют для производства многих материалов, например, пластмасс;
Разрабатываются способы защиты различных веществ от разрушения микроорганизмами;
Микробиологическое выщелачивание руд.
Экологическая биотехнология. Давно известны и широко применяются микробиологические способы очистки сточных вод и переработки отходов. Перспектива – использование микроорганизмов с ранее известными или искусственно созданными катаболическими способностями.
Биодатчики для мониторинга и контроля окружающей сферы.
Таблица 3 - Экономические и коммерческие аспекты биотехнологии. Оценка спроса на мировом рынке в 2010 году на различные продукты «новой» биотехнологии
Это в 6 раз больше, чем дает сейчас бродильная промышленность.
Связь микробиологии с химическими технологиями дала результаты, с внедрением биотехнологии в промышленность произойдет переход от тяжелой индустрии к высоким технологиям. Внедрение биотехнологии в практику изменяет соотношение в системе: человек- производство- природа, повышает производительность труда. Широкое использование биотехнологических процессов способствует стиранию грани между промышленным и сельским производством, поскольку продукты питания, корма и другие сельскохозяйственные продукты вырабатываются в индустриальных условиях. В настоящее время достижения биотехнологии перспективно использовать в следующих отраслях:
В промышленности (химическая, нефтяная, фармацевтическая, пищевая);
В экологии;
В энергетике;
В сельском хозяйстве;
В медицине.
Биотехнология - межотраслевая дисциплина и ее развитие невозможно без открытий в других отраслях и дисциплинах. Бурное развитие современной молекулярной биологии и генетики, опирающихся на достижения химии и физики, позволяет использовать потенциал живых организмов в интересах хозяйственной деятельности человека (т.е. они изучают жизненные явления на клеточном и молекулярном уровне). Клеточная и генная инженерия позволяет получать новые штаммы-продуценты.
Вопросы для самопроверки
1. Какие преимущества имеют биотехнологические методы
2. В каких направлениях наиболее перспективно развитие биотехнологии
3. Какими принципами регламентируется выбор объектов биотехнологии
4. Связь микробиологии с химическими технологиями
5. Будущее сельскохозяйственной биотехнологии
6. Внедрение биотехнологии в практику
7. Наиболее старое и традиционное использование способностей микроорганизмов
8. Перспективность и эффективность применения биотехнологических процессов
Лекция 2. Значение микроорганизмов как объектов биотехнологических производств. Своеобразие и скорость обмена веществ у микроорганизмов. Использование в биотехнологии мутантных и гибридных продуцентов
Форма проведения лекции: проблемная
План лекции
1. Значение микроорганизмов как объектов биотехнологических производств
2. Своеобразие и скорость обмена веществ у микроорганизмов
3. Теоретические основы процесса селекции
4. Выбор исходного микроорганизма для селекции
5. Подготовка селекционного материала к селекционной работе
6. Получение мутантов
7. Отбор положительных мутантов
1. Биологический агент является активным началом в биотехнологических процессах и одним из наиболее важных ее элементов. Номенклатура биологических агентов бурно расширяется, но до настоящего времени важнейшее место занимает традиционный объект – микробная клетка.
Микробные клетки с различными химико-технологическими свойствами могут быть выделены из природных источников и далее с помощью традиционных (селекция, отбор) и новейших методов (клеточная и генетическая инженерия) существенно модифицированы и улучшены. При выборе биологического агента и постановке его на производство прежде всего следует соблюдать принцип технологичности штаммов. Это значит, что микробная клетка, популяция или сообщество особей должны сохранять свои основные физиолого-биохимические свойства в процессе длительного ведения ферментации. Промышленные продуценты также должны обладать устойчивостью к мутационным воздействиям, фагам, заражению посторонней микрофлорой (контаминации); характеризоваться безвредностью для людей и окружающей среды, не иметь при выращивании побочных токсичных продуктов обмена и отходов, иметь высокие выходы продукта и приемлемые технико-экономические показатели.
В настоящее время многие промышленные микробные технологии базируются на использовании гетеротрофных организмов, а в будущем решающее место среди продуцентов займут автотрофные микроорганизмы, не нуждающиеся для роста в дефицитных органических средах, а также экстремофилы – организмы, развивающиеся в экстремальных условиях среды (термофильные, алкало- и ацидофильные). В последние годы расширяется применение смешанных микробных культур и их природных ассоциаций. По сравнению с монокультурами, микробные ассоциации. способны ассимилировать сложные, неоднородные по составу субстраты, минерализуют сложные органические соединения, имея повышенную способность к биотрансформации, имеют повышенную устойчивость к воздействию неблагоприятных факторов среды и токсических веществ, а также повышенную продуктивность и возможность обмена генетической информацией между отдельными видами сообщества. Основные области применения смешанных культур – охрана окружающей среды, биодеградация и усвоение сложных субстратов. Особая группа биологических агентов в биотехнологии – ферменты, так называемые катализаторы биологического происхождения. Ферменты находят все большее применение в различных биотехнологических процессах и отраслях хозяйствования, но до 60-х годов это направление сдерживалось трудностями их получения, неустойчивостью, высокой стоимостью. Как отдельную отрасль в создании и использовании новых биологических агентов следует выделить иммобилизованные ферменты, которые представляют собой гармонично функционирующую систему, действие которой определяется правильным выбором фермента, носителя и способа иммобилизации. Преимущество мобилизованных ферментов в сравнении с растворимыми заключается в следующем: стабильность и повышенная активность, удержание в объеме реактора, возможность полного и быстрого отделения целевых продуктов и организации непрерывных процессов ферментации с многократным использованием биологического агента. Иммобилизованные ферменты открывают новые возможности в создании биологических микроустройств для использования в аналитике, преобразовании энергии и биоэлектрокатализе. К нетрадиционным биологическим агентам на данном этапе развития биотехнологии относят растительные и животные ткани, в том числе гибридомы, трансплантанты. Большое внимание в настоящее время уделяется получению новейших биологических агентов – трансгенных клеток микроорганизмов, растений, животных генноинженерными методами. Развиты также новые методы, позволяющие получать искусственные клетки с использованием различных синтетических и биологических материалов (мембраны с заданными свойствами, изотопы, магнитные материалы, антитела). Разрабатываются подходы к конструированию ферментов с заданными свойствами, имеющими повышенную реакционную активность и стабильность. В настоящее время реализован синтез полипептидов желаемой стереоконфигурации и пр.
Таблица 4 - Микрооорганизмы, используемые в промышленности
для получения целевых продуктов
| Организм | Тип | Продукт |
| Saccharomyces cerevisiae | Дрожжи | Пекарские дрожжи, вино, эль, саке |
| Streptococcus thermophilus Propionibacterium shermanii | Бактерии Бактерии | Иогурт Швейцарский сыр |
| Gluconobacterium suboxidans | Бактерии | Уксус |
| Penicillium roquefortii | Плесень | Сыры типа рокфора |
| Aspergillus oryzae | Плесень | Саке |
| Saccharomyces cerevisiae | Дрожжи | Этанол |
| Clostridium acetobutylicum | Бактерии | Ацетон |
| Xanthomonas campestris | Бактерии | Полисахариды |
| Corynebacterium glutamicum | Бактерии | L-Лизин |
| Candida utilis | Дрожжи | Микробный белок |
| Propionibacterium | Бактерии | Витамин В 12 |
| Aspergilus oryzae | Плесень | Амилаза |
| Kluyveromyces fragilis | Дрожжи | Лактаза |
| Saccharomycopsis lipolytica | Дрожжи | Липаза |
| Bacillus | Бактерии | Протеазы |
| Endothia parasitica | Плесень | Сычужный фермент |
| Leocanostoc mesenteroides | Бактерии | Декстран |
| Xanthomonas campestris | Бактерии | Ксантан |
| Penicillium chrysogenum | Плесень | Пенициллины |
| Chehalosporium acremonium | Плесень | Цефалоспирины |
| Rhizopus nigricans | Плесень | Трансформация стероидов |
| Гибридомы | – | Иммуноглобулины и моноклональные антитела |
| Клеточные линии млекопитающих | – | Интерферон |
| E. coli (рекомбинантные штаммы) | Бактерии | Инсулин, гормон роста, интерферон |
| Blakeslea trispora | Плесень | b-Каратин |
| Phaffia rhodozyma | Дрожжи | Астаксантин |
| Bacillus thuringiensis | Бактерии | Биоинсектициды |
| Bacillus popilliae | Бактерии | Биоинсектициды |
Таблица 5 - Важнейшие группы субстратов, биологических агентов и образуемых в биотехнологических процессах продуктов
|
Таким образом, в биотехнологических процессах возможно использование различных биологических агентов с различным уровнем организации, – от клеточной до молекулярной.
2. Все биотехнологические процессы в биотехнологии микроорганизмов основываются на функционировании микробных клеток, поэтому биотехнология начинается с познания живой клетки и законов управления процессами жизнедеятельности. По своему строению микробные клетки бывают прокариотические (бактерии сине-зелёные водоросли) и эукариотические (грибы, водоросли, простейшие). Живая клетка- сложный химический реактор, в котором протекает более 1000-чи независимых реакций, катализируемых ферментами. Тем не менее биологической системы подчиняются тем же основным законам сохранения вещества и энергии и тем же принципам, что и процессы химической технологии. Микроорганизмы могут усваивать световую энергию - фототрофы и химическую - хемотрофы. Гетеротрофы могут усваивать только органические вещества, а афтотрофы не органические вещества (например СО2).
Полученная энергия хранится и транспортируется внутри клетки в виде высокоэнергетических соединений типа АТФ, а клетки используют энергию для выполнения 3-х функций:
1. для роста, для синтеза больших, сложных молекул
2. транспорта ионных и нейтральных соединений
3. механической работы, то есть деление и передвижение
Эффективность использования энергии в биосинтезе высокая, остальная энергия превращается в тепло.
Метаболизм – это совокупность всех химических превращений клетки.
Метаболизм складывается из катаболизма (распад веществ, разложение химических веществ для получения энергии) и анаболизма (образования сложных веществ клетки из простых, с затратами энергии) амфиболизм (все реакции промежуточного обмена)
Микроорганизмы бывают аэробные (требуется О2 для дыхания) и анаэробные (существуют без кислорода). При анаэробном расщеплении (брожении) органические вещества не разлагаются до простых конечных, по этому энергии высвобождается мало. При аэробном обмене (дыхании) получаются бедные энергией конечные продукты (СО2 и Н2О) и высвобождается много энергии
Брожение (спиртовое):
С6Н12О6 + 2Н3РО4 + 2АДФ = 2С2Н5ОН + 2АТФ +2СО2
С6Н12О6 + 6О2 + 36Н3РО4 + 36АДФ = 6СО2 + 6Н2О + 36АТФ + 36Н2О
Таким образом из 1 моля глюкозы при дыхании образуется 36 моль АТФ и 2847 кДж, а при анаэробном процессе только 2 моли АТФ и 217 кДж, то есть в 18 раз меньше. По этому в аэробных условиях рост клеток более эффективен
При дыхании водород получаемый в результате гликолиза, транспортируется к кислороду. В результате гликолиза из одной молекулы глюкозы образуется по две молекулы пирувата, АТФ и NADH2. Пируват подвергается окислительному декарбоксилированию при участии мультиферментного комплекса и нескольких коферментов. Один кофермент принимает отщеплённый водород, а другой кофермент А(СоА-Н) присоединяет оставшуюся ацетильную группу СоСН2.
При дыхании ацетильный остаток полностью расщепляется в цикле трикарбоновых кислот (ЦТК) в результате окисления и отщепления Н, декарбоксилирования (отщепления СО2) и гидратации (присоединения Н2О).
Основную энергию для синтеза АТФ при дыхании клетка получает в результате окисления кислородом водорода, получаемого в результате гликолиза, окисления пирувата и реакции ЦТК. Последняя стадия катаболизма – окислительное фосфорилирование. В ходе этого процесса высвобождается большая часть метаболической энергии, при этом молекулы NADH и FADH2 переносят электроны от молекулы питательных веществ к молекуле О 2. Фосфорилирование осуществляется в дыхательной цепи под воздействием фермента АТФ-синтетазы
В цепи дыхания при переносе Н от NAD H к О2 освобождается 218 кдж на 1-моль NAD H.
Ассимиляция (анаболизм) у автотрофных и гетеротрофных организмов.
Ассимиляция – синтез собственных веществ тела из неорганических (СО2, Н2О, NH3-автотрофная) или из органических соединений (гетеротрофная).
Потребность в энергии удовлетворяется либо за счет световой энергией в процессе фотосинтеза, либо за счет окисления неорганических веществ (H2S,NH3 и др.) в процессе хемосинтеза.
Фотосинтез-преобразование энергии света в химическую, которая накапливается в форме АТФ и водорода связанного с коферментом (NAD H).
Он состоит из 2-х процессов: светового – преобразования энергии, фотонов hv и темнового - образования углеводов.
Восстановитель Н2 образуется при разложении Н2О при фотосинтезе:
12Н2О hv 12 Н2+6О2+АТФ
АТФ синтезируется при прохождении электронов по цепи транспорта электронов
6СО2+12Н2 в темноте С6Н12О6+6Н2О.
Бактериальные и растительные клетки сами синтезируют все 20 аминокислот, входящих в состав белков (в зеленых клетках в хлоропластах)
Гетеротрофная ассимиляция сводится в основном к процессам перестройки молекул, иногда организму достаточного только одного органического вещества, чтобы синтезировать все необходимые соединения, другие же организмы должны получать совершено определённые, незаменимые вещества, например аминокислоты и витамины и др.
3. Промышленно важные продукты жизнедеятельности микроорганизмов по их природе и значению для самой микробной клетки делят на три основные группы:
Крупные молекулы (ферменты, полисахариды с молекулярной массой от 10 тыс. до нескольких миллионов);
Первичные метаболиты (соединения, необходимые микроорганизмам для роста: аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые нуклеотиды, витамины и др.);
Вторичные метаболиты (соединения, ненужные микроорганизмам для роста: антибиотики, токсины, алкалоиды, факторы роста растений).
Первичные и вторичные метаболиты микробного происхождения обычно имеют довольно низкую по сравнению с ферментами молекулярную массу менее 1,5 тыс.
Биологическую активность эти вещества проявляют различно: удовлетворяют потребности человека и животных, взаимодействуют с микроорганизмами, насекомыми, растениями, участвует в разложении различных органических субстратов. Кроме того, некоторые аминокислоты могут служить сырьем для дальнейших превращений на основе химического синтеза.
Продукты микробного синтеза для того, чтобы стать объектом рентабельного промышленного производства, должны выделяться микробной клеткой в питательную среду и накапливаться в среде в количествах, которые оправдывали бы сырьевые и энергетические затраты на культивирование микроорганизма и выделение продукта в необходимой для дальнейшего использования форме. В большинстве случаев выбор микробиологического способа получения того или иного вещества обусловлен полным отсутствием или весьма ограниченной возможностью получения его другими способами, в первую очередь путем химического синтеза. Многие антибиотики, ферменты, биологически активные изомеры ряда аминокислот, пуриновые нуклеотиды, токсины, факторы роста растений в настоящее время возможно или, по крайней мере, гораздо проще получать с помощью микроорганизмов из доступного и дешевого сырья, чем осуществлять сложный, многоэтапный химический синтез, или даже один-два этапа ферментативного синтеза, но на основе сложного и часто малодоступного сырья.
Однако природные штаммы микроорганизмов, как правило, не обладают способностью выделять и накапливать в питательной среде, т. е. продуцировать, такое количество нужного продукта, которое обеспечило бы достаточно низкую его стоимость и требуемый объем производства. Природные штаммы некоторых групп микроорганизмов (несовершенные грибы, актиномицеты, бациллы) способны выделять в окружающую среду сравнительно небольшие количества антибиотиков, токсинов или гидролитических ферментов. Первичные метаболиты, как правило, микроорганизмами не выделяются в значительном количестве (синтезируемое количество этих веществ строго ограничено и рассчитано на потребности самой клетки). Исключение из этого правила - выделение глутаминовой кислоты природными штаммами (так называемой группы глутаматпродуцирующих коринебактерий) - не распространяется на подавляющее большинство других аминокислот.
В связи с этим задача селекционера - не только усиление природной способности микроорганизма продуцировать определенное вещество (антибиотик, фермент, токсин и др.), но во многих случаях и создание продуцента «заново» из штамма дикого типа, способного синтезировать вещество (например, аминокислоту), но не способного его продуцировать. Эти задачи осуществляются получением у природных штаммов наследственных изменений - мутаций, приводящих к усилению природной способности микроорганизмов синтезировать и продуцировать определенное вещество, а также появлению новой способности - синтезировать вещество в избытке - сверх своих потребностей и продуцировать его.
Дальнейшее повышение уровня продукции того или иного вещества у микроорганизма - это постоянная цель работы селекционеров, так как наиболее эффективный способ интенсификации микробиологического производства, не требующий дополнительных капиталовложений, заключается в использовании более продуктивного штамма.
Синтез микроорганизмами первичных или вторичных метаболитов можно представить себе как процесс, начинающийся с поглощения клеткой субстрата (источников углерода и азота, микроэлементов и т. д.) и проходящий затем ряд этапов, катализируемых различными ферментами, часть которых участвует в регуляции синтеза нужного вещества или его предшественников. На отдельных этапах промежуточные вещества могут служить предшественниками других метаболитов и расходоваться на их синтез. Предшественники определенного вещества могут быть промежуточными или конечными продуктами других путей синтеза, иметь собственную регуляцию и расходоваться на другие потребности клетки. Кроме того, продуцируемое вещество должно преодолевать барьер проницаемости и накапливаться в среде культивирования, не подвергаясь деградации под действием ферментов, которые может синтезировать микробная клетка.
Теоретически мутации, способствующие сверхсинтезу продукта, могут затрагивать большое число структурных генов, кодирующих ферменты всех этапов синтеза, транспорта и катаболизма данного продукта, а также регуляторные гены. Результат таких мутаций может проявиться в различных изменениях метаболизма клетки:
Повышение скорости поглощения и утилизации субстрата клеткой;
Повышение уровня синтеза биосинтетических ферментов или их активности, в частности, за счет нарушения негативного контроля синтеза и активности регуляторных ферментов в пути синтеза продукта или его предшественников;
Блокирование побочных реакций синтеза для снижения расхода общих предшественников на синтез других метаболитов;
Блокирование дальнейшего внутриклеточного превращения продукта, если оно происходит;
Обеспечение эффективной экскреции продукта из клетки;
Блокирование деградации продукта;
Усиление позитивных форм регуляции синтеза продукта.
Если желаемым продуктом является выделяемый клеткой фермент (чаще всего это гидролитические ферменты, хотя в последнее время большой интерес проявляется и к ряду оксидоредуктаз, в частности, участвующих в катаболизме аминокислот), то мутации, способствующие усилению его образования и активности, а также накоплению в среде, могут затрагивать:
Структурный ген, приводя к синтезу мутантного фермента, не чувствительного к ингибированию конечным продуктом реакции, и (или) повышая его активность (число оборотов, т. е. число молей превращаемого субстрата в минуту); мутация в промоторной части гена должна усилить частоту инициации транскрипции или вызвать синтез фермента;
Гены, кодирующие белки, участвующие в регуляции синтеза данного фермента (в частности, по типу катаболитной репрессии, имеющей разнообразные формы проявления и в общем виде выражающейся в обратной зависимости синтеза катаболитчувствительного фермента от скорости роста клеток), мутации в этих генах должны устранить или ослабить факторы, ограничивающие синтез фермента;
Гены, кодирующие ферменты, которые могут гидролизовать и инактивировать нужный фермент, мутации должны уменьшить или устранить такую возможность;
Гены, ответственные за синтез компонентов клеточных мембран, которые участвуют в «сборке» (у эукариотов) и экскреции ферментов, мутации в этих генах могут повысить эффективность указанных процессов.
Приведенный перечень теоретически возможных, «участвующих» в сверхсинтезе мутаций, очевидно, не полон, так как наши сведения о регуляции биосинтеза того или иного метаболита и взаимосвязях с другими процессами в клетке не являются исчерпывающими, не любая из перечисленных мутаций может вызвать сверхсинтез. Чаще всего требуется сочетание нескольких мутаций, среди которых могут быть «главные» и «вспомогательные». Последние необходимы для проявления или наибольшего выражения первых. Вместе с тем возможно и отсутствие значительного уровня продукции даже в случае, когда большинство из теоретически необходимых для этого мутаций получено у микроорганизма и, наоборот, селекционер может быть избавлен от необходимости получать множество разных мутаций, если он удачно выбрал исходный природный тип микроорганизмов.
4. Разнообразие природных форм позволяет выбрать микроорганизм, который имеет меньшее число ограничений для сверхсинтеза какого-то вещества, хотя при этом и не продуцирует его. Так, оказалось очень сложным и на практике пока еще недостижимым получить промышленно значимый уровень продукции L-лизина у кишечной палочки или псевдомонад, но весьма легким у представителей глутаматпродуцирующих коринебактерий: Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavит и др. Исходя из имеющихся данных, объяснить это можно менее сложной регуляцией синтеза лизина у коринебактерий (в процессе синтеза лизина всего один фермент контролируется по типу поливалентного ингибирования активности лизином и треонином, и этот контроль устраняется мутацией, блокирующей синтез гомосерина - предшественника треонина и метионина, при этом поток общих предшественников направляется только на синтез лизина), а также отсутствием деградации лизина по сравнению с регуляцией у кишечной палочки (три контролируемых фермента и более сложные формы регуляции) и выраженной способностью к деградации лизина у псевдомонад.
В ряде случаев природные штаммы с менее сложными системами ограничений сверхсинтеза выделяют в среду некоторое количество первичного метаболита, например, штамм гриба Еremothecium ashbyii способен продуцировать витамин В 2 , а Рrоpionibacterium shermanii- B 12 . Такие микроорганизмы, конечно, становятся объектами селекции на повышение уровня продукции выделяемого вещества. Пригодность микроорганизма (не выделяющего нужное вещество, обычно первичный метаболит, но привлекающего исследователя какими-то свойствами) для использования в качестве объекта селекции на получение продуцента этого вещества можно проверить, введя ему одну или несколько определенных, легко тестируемых мутаций, которые теоретически должны вызвать сверхсинтез данного вещества и, может быть, уже были «апробированы» на другом микроорганизме. Это самый надежный способ выбора исходного штамма, даже если для этого вида микроорганизма нет данных о регуляции синтеза желаемого вещества. Для продуцентов вторичных метаболитов, а также ферментов или полисахаридов выбор исходного штамма предрешен способностью природного микроорганизма продуцировать какое-то количество нужного вещества. В тех случаях, когда одно и то же вещество выделяют природные штаммы, относящиеся к разным таксономическим группам (например, грибы и бациллы), это может позволить выбрать более "технологичный" для будущего производства или более поддающийся селекции штамм.
Таким образом, селекционер чаще всего не свободен в выборе исходного для селекции штамма и не может считать критерием такого выбора генетическую изученность микробного объекта и возможность применения к нему разнообразных генетических методов. Природные свойства штаммов, определяющие этот выбор, безусловно, облегчают и ускоряют селекционную работу. Однако отсутствие у многих промышленных микроорганизмов систем обмена информацией не позволяет ни изучить генетический контроль синтеза продуцируемого вещества, ни облегчить насыщение генома продуцента необходимыми для сверхсинтеза мутациями.
5. У микроорганизма, выделяющего продукт и взятого в качестве объекта селекции, необходимо изучить естественную изменчивость по морфологическим признакам и по количественному признаку - уровню продукции желаемого вещества. После рассева исходного штамма на чашки Петри среди не менее 100 (а лучше нескольких сотен) колоний выявляют типичную для данной культуры морфологическую форму и отклонения от нее. Затем изолированные на косяки колонии (клоны) как типичной формы (не менее 100 клонов), так и доступное число ее морфологических вариантов (убедившись предварительно, что эти варианты сохраняют свои особенности при пересевах) оценивают после соответствующего способа культивирования по уровню продукции вещества, применяя надежный аналитический метод. Такая оценка позволяет выявить вполне возможную корреляцию между способностью продуцировать данное вещество и морфологией колоний.
Несколько клонов с наиболее высоким уровнем продукции по отношению к уровню контроля, которым является исходная (не рассевавшаяся) культура, отбирают и проверяют на продукцию в нескольких повторных опытах, а затем отбирают один клон, характеризующийся высоким и воспроизводимым уровнем. Такая процедура, которую иногда называют «чисткой» исходной культуры, довольно часто приводит к отбору клона с заметно повышенной продукцией, а в некоторых случаях - и с отклонением от типичной морфологии.
Отобранный из рассева исходной культуры клон снова рассевают, отмечают морфологическую изменчивость, если она есть и затем оценивают по уровню продукции не менее 100 типичных для данного клона изолированных на косяки колоний. Целесообразно значения уровней продукции таких субклонов, выраженные в процентах по отношению к продукции исходного для них (родительского) клона, распределить в вариационном ряду и вычислить статистические показатели: среднее арифметическое X, квадратическое отклонение, δ коэффициент изменчивости
Субклоны, попавшие в крайнюю правую часть этого ряда, отбирают, повторно оценивают по уровню продукции и оставляют один из них. Этот субклон рассевают и, как и в предыдущем случае, проверив не менее 100 колоний, строят вариационный ряд и вычисляют его показатели. Получив, таким образом, два вариационных ряда, сравнивают значения cv этих рядов. Если эти значения достоверно не различаются, можно подготовку исходного штамма для дальнейшей селекции закончить отбором субклона из первого вариационного ряда, а второй ряд (собственный ряд этого субклона) считать контрольным для следующего этапа селекции с применением мутагенных факторов. При обнаружении у cv второго ряда явной тенденции к уменьшению целесообразно провести еще один этап клонирования, выбрав из правой части второго ряда «лучший» построить третий вариационный ряд на основе его рассева определить cv. Цель такого ступенчатого клонирования - «стабилизировать» исходную культуру по количественному признаку, получив на основе действия стабилизирующего отбора наиболее однородную по данному признаку популяцию как надежный контроль при оценке индуцируемой мутагенами изменчивости и последующем отборе мутантов. Следует иметь в виду, что однородность отобранной культуры снижается при многократном пассировании и длительном хранении. Поэтому исходную культуру, которая должна служить контролем при отборе мутантов, необходимо поддерживать периодическим клонированием, проводимым в установленные для данной культуры промежутки времени. Повысить уровень продукции таким клонированием, т. е. отобрать мутант, как правило, не удается. Средний уровень продукции клонов, отбираемых из правой части вариационного ряда, построенного на основе естественной изменчивости культуры, обычно равен среднему уровню продукции родительской культуры.
В том случае, когда исходная культура нужное вещество не продуцирует, следует выбрать из ее рассева колонию, которая по таксономической характеристике полностью соответствует данному виду микроорганизма, и использовать этот клон в дальнейшей работе с применением мутагенов.
6. Разнообразные типы мутации получают с помощью различных физических и химических мутагенных факторов. Биологический материал, подвергаемый воздействию мутагенных факторов, должен быть дискретным и содержать минимальное количество ядер, что позволяет устранить или сократить стадию сегрегации. Обычно это споры, вегетативные клетки или даже обрывки мицелия у неспорулирующих организмов. Суспензия, содержащая клетки или споры, должна быть по возможности лишена комков - конгломератов, так как мутация в одной из клеток конгломерата при прорастании его на агаризованной среде будет утрачена или в лучшем случае проявится в виде сектора. Комки разбивают на качалке, фильтруют суспензию, но полностью избавиться от их присутствия в обрабатываемой мутагеном суспензии обычно не удается.
Физическими факторами (УФ-излучение и различные виды ионизирующей радиации) обрабатывают водную суспензию спор или клеток. При обработке химическими факторами (чаще всего это алкилирующие агенты: алкилметансульфонаты, алкил-сульфаты, алкилнитрозомочевина, метилнитрозогуанидин и др.) следует соблюдать условия, способствующие максимальному проявлению мутагенной активности данного вещества. Большую роль в этом отношении играет рН раствора, поэтому обработку проводят в буферных растворах при наиболее эффективных для данного мутагена значениях рН.
У актиномицетов и коринебактерий, обработанных парами диэтилсульфата (для этого достаточно нанести каплю веществ на стенку пробирки с выросшей культурой и выдержать несколько часов в термостате), появляется в несколько раз больше морфологических мутаций, чем после обработки в водном растворе мутагена.
Доза воздействия мутагена выражается в единицах излучения, соответствующих типу радиации. Для химических мутагенов доза характеризуется концентрацией мутагена в обрабатываемой суспензии и экспозицией при определенной температуре. После экспозиции обработку химическим мутагеном прерывают отмыванием материала (применяя осаждение его центрифугированием), помещением в буферную смесь с неоптимальным для мутагенного эффекта значением рН и (или) серией разведений в физиологическом растворе, предшествующей высеву на агаризованную среду. Если при поиске определенных типов мутаций суспензия должна быть высеяна на агар без разведения, то отмывание от мутагена необходимо.
При выборе дозы мутагена ориентируются на выживаемость обрабатываемого микроорганизма, последняя определяется отношением числа колоний, выросших на агаре после мутагенного воздействия, к числу колоний, выросших после посева той же, но не обработанной мутагеном (контрольной) суспензии клеток, выраженных в процентах. Выживаемость зависит как от дозы мутагена, так и от чувствительности данного микроорганизма к летальному эффекту мутагена, причем чувствительность может значительно различаться у нескольких штаммов одного вида микроорганизма. В селекционной работе, как правило используются дозы, обеспечивающие выживаемость клеток в диапазоне от 0,1 до 50 – 80 %.
7. Иногда для этого удаётся использовать естественный отбор. Например, хересные винные дрожжи (Sacharomyces oviformis) , способные переокислить спирт в продукты, придающие вину хересный букет, не размножаются при концентрациях спирта больше 15 %. Культивируя их при постепенном увеличении концентрации спирта до 18 %, удалось выделить штамм, способный к образованию хереса в этих условиях.